拟南芥（Arabidopsis thaliana）遗传转化实验技术

实验原理

拟南芥是植物领域应用较为广泛的模式生物。由于具有较小的基因组（135 Mbp），生命周期短，可以在多种环境下生长，一直被视为研究植物遗传学、进化、种群遗传学和植物生长发育的系统。

农杆菌介导的蘸花法是目前相对成熟、应用较为广泛的拟南芥稳定遗传转化方法。转化步骤大致如下：拟南芥（T0代）的花序浸没在一定浓度的含有目标转化质粒的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（常用的根癌农杆菌菌株为GV3101）悬浮液中，然后放在一定条件下进行培养（图1 a-e）。待植物成熟后收集T0代植物的种子，将这些种子放在含有特定抗生素的培养基上进行生长筛选（图1f），获得阳性植株。与其他植物转化方法相比，蘸花法需要较少的人力和专用试剂，所需设备相对简单且转化效率较高（在优化的条件下大于1%）（1）。

实验步骤

1、长日照 (光照16 h、黑暗8 h) 环境下种植健壮的拟南芥植株 (约5周)。

剪掉最开始抽出的1-5 cm长的初生主花序 (促进长出更多的侧生花序)。修剪后一个星期内进行渗透转化 (一般3~5 d)。并且在渗透转化的前1 d植株需充分浇水，以便植物气孔在转化时充分张开。

2、准备农杆菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培养基培养已经转化了目的表达载体的农杆菌液，然后再吸取150 μl培养过夜的菌液加入到150 ml 新鲜的液体LB培养基中28 °C环境下震荡培养24 h。

3、4,000 x g，20 min离心菌液，然后将菌重悬于120 ml渗透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77，蘸花前充分混匀，OD600=0.8-1.0) 中。与此同时，剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花。

4、将植株的地上部分浸入菌液中1 min，轻微震荡。

5、用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度，暗培养1 d，然后置于正常培养条件，2~3 d后可去掉保鲜膜，转化后1周左右方可浇水，并定期继续侵染几次。

继续培养至植物成熟，收种子放在干燥环境中1周左右，即可筛选转化子。

6、注意事项

在去除初生花序后，次生花序约2-10 cm时最适宜侵染。因为此时有许多可用来侵染的花蕾。

渗透液浓度在0.15~1.74之间时，转化率没有明显变化。

Silwet L-77浓度在0.02%~0.1%时，转化率是0.005%时的10-20倍，故一般采用的浓度为0.05%。但是，值得注意的是利用高浓度的Silwet L-77进行侵染时，在某些环境下会导致植物组织坏死。

参考文献

1.Ghedira R.; et al. (2013) The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Moecular Plant Microbe Interaction, 26(7), 823-832.

2. Zhang, X.; et al. (2006). Agrobacteriumdiated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols, 1(2), 641-645.