一、酵母双杂交

1. 阳性克隆的筛选

（1）随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coliKC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。

（2）如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。

2. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆

（1）将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10%-20%左右的频率随机丢失。

（2）将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30°C孵育2-3天。

（3）再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。

（4）将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。

3. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆

如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。

质粒1

(in YM4271) 质粒2

(in EGY48) LacZ表型 Leu表型

pLexA pB42AD 白 不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生长

pLexA pB42AD-文库 白 不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD-文库 蓝 真 阳 性

pLexA-Lam pB42AD-文库 白 不能生长

4. 阳性克隆的进一步筛选和确证

（1）扩增初步确定的阳性克隆，提取酵母DNA。它既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。

（2）将上述DNA电转化E.coli KC8。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容;同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并提取质粒DNA，酶切鉴定。

（3）用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。

（4）扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。

5. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究

（1）用不同的双杂交系统验证

将载体 pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。

选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。

将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。

去除或突变特定结合位点，定量检测b-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。

（2）用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。

（3）用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。

（4）进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系

6、酵母双杂交系统的应用

可研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。相信随着分子生物学技术的发展与推广，酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。

心得体会：酵母双杂交技术主要是用于研究蛋白质之间的相互作用，核心关键步骤是酵母细胞的培养，它关系到酵母细胞的浓度和生长状态，一定要严格控制酵母细胞的培养时间。

二、酵母单杂交

1 pBait-AbAi 载体的构建（酵母报道子的构建）

酵母报道子（pBait-AbAi） 包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到 pAbAi 载体 AbAi r 报告基因的上游。 大量研究表明最有效的构建应包含目的 DNA 三个以上的首尾连接的拷贝。 首尾连接的拷贝产生方式很多， 但对于长度小于 20 bp 的调控元件， 人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。

2 质粒转化酵母细胞， 生成 Bait-Reporter 酵母菌株（图）

3 检测诱饵菌株 AbA r 基因的表达

在不存在捕获物的情况下， 由于克隆到 pAbAi 载体中的诱饵序列不同， 诱饵菌株报告基因 的本底表达水平也不相同 。 例如： p53-AbAi 对照的最低aureobasidin A 抑制浓度为 100 ng/ml。

注： 酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。 因此在进行文库筛选之前， 检测所构建的诱饵菌株 AbA r 基因的表达情况十分重要。 所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的 AbA 浓度。

4 文库 cDNA 的合成

提取试材总 RNA， 进行反转录合成 cDNA。 合成的 cDNA 末端具有与pGADT7-Rec 相同的酶切位点。

5 构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA 融合表达文库的构建及筛选）

6 阳性克隆的鉴定及 cDNA 质粒的分离