题目：Identification of TaGL1-B1 gene controlling grain length through regulation of jasmonic acid in common wheat

刊名：Plant Biotechnology Journal

作者：Mohsin Niaz，Feng Chen et al.

单位：Henan Agricultural University, Zhengzhou

日期：17 January 2023

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摘要

粒长是决定小麦产量的最重要因素之一。在此，在 F 10重组自交系 (RIL) 群体的染色体 1B 上定位了一个稳定的粒长 QTL ，并通过多种策略在次级大群体中鉴定了编码类胡萝卜素异构酶的基因TaGL1-B1 。对 243 份小麦种质的全基因组关联研究 (GWAS) 显示， TaGL1-B1标记在所有染色体中最显着。TaGL1的 EMS 突变体拥有显着减少的谷粒长度，而TaGL1-B1过表达的品系拥有显着增加的谷粒长度。此外，TaGL1-B1 与 TaPAP6 有强烈的相互作用。TaPAP6过表达品系的粒长显着增加。转录组分析表明TaPAP6可能参与了 JA（茉莉酸）的积累。一贯地，JA 含量在TaGL1-B1和TaPAP6过表达细胞系中显着增加。此外，通过 QTL 作图、GWAS、EMS 突变体和过表达系验证了TaGL1-B1在调节类胡萝卜素中的作用。值得注意的是，TaGL1-B1的过表达显着增加了多个位置的小麦产量。总之，TaGL1-B1的过度表达增加籽粒长度，可能是通过与 TaPAP6 的相互作用导致 JA 的积累，从而提高类胡萝卜素含量和光合作用，从而导致小麦产量增加。该研究提供了有价值的控制籽粒长度以提高产量的基因，并可能深入了解调节小麦中 JA 介导的籽粒大小的分子机制。

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技术路线

小粒 UC111 和大粒 PI610750（UP-RIL）培育而成的双亲本 F 10重组自交系（RIL）群体，共有 187 个品系

遗传连锁图谱由 IciMapping V4.1 ( http://www.isbreeding.net/ )使用 1494 个标记构建

UC1110 和 PI610750 基因组重测序

基因分型和全基因组关联研究

TaGL1基因的 EMS 突变体

将TaGL1-B1和TaPAP6的 CDS克隆到具有 Ubi 启动子的小麦 LGY-OE3 载体中。这些包含目标基因的载体通过农杆菌介导的感染转化到六倍体小麦品种Fielder的未成熟胚中，以获得TaGL1 -OE和TaPAP6 -OE品系

定量RT-PCR、RNA测序分析、酵母双杂交试验

亚细胞定位、分裂荧光素酶互补试验

类胡萝卜素、叶绿素、JA和ABA的测定

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主要结果

3.1 调控小麦粒长的TaGL1-B1鉴定

RIL（重组近交系）种群 UC1110/PI610750 (UP-RIL) 中籽粒长度 (GL) 的连锁作图揭示了染色体 1B 上的两个稳定 QTL。Qgl1.hau.1B的两侧是标记Wpt-5279和wPt-1251，连续 3 年的表型方差解释 (PVE) 为 7.67%–14.45%（图 1a；表 S1）。Qgl2.hau.1B 基因座两侧是标记wPt-9508和Id031，PVE 为 9.59%–12.28%（表 S1）。作为Qgl1.hau.1B显示出相对较高的 PVE 和 LOD 值，我们主要关注这个 QTL，以便在本研究中进一步分析。Chinese Spring 基因组中的基因注释显示Qgl1.hau.1B (87.97–95.50 Mb) 涵盖了 50 个推定的注释基因（表 S2）。基于两个亲本的基因组重测序和Sanger测序，50个候选基因中有43个在PI610750和UC1110之间存在多态性，这些多态位点随后被用于开发43个基因标记。

为了精确定位Qgl1.hau.1B，使用四个侧翼标记wPt-5279/wPt-1251（Qgl1.au.1B）和wPt-9508/Id031（Qgl2.hau.1B）对由PI610750和UC1110衍生的5000株植物组成的二级F2群体进行了基因分型，在1206株极长粒和极短粒的植物中，种植了300株以产生F2:3系。此外，通过43个基因标记随机选择F2和F2:3系中的48个极长粒系和48个极短粒系进行基因型分析。

结果表明，聚类到0.98-Mb物理区间的10个基因标记显示出与晶粒长度的共分离（图1b，c；表S3）。从WheatOmics数据库检索的表达水平分析(http://202.194.139.32/)显示10个基因中只有性状CS1B02G090300在谷物中高度表达（图1d；表S4）。测序结果显示，标记为脯氨酸青霉烯异构酶的性状CS1B02G090300在两个亲本之间的氨基酸水平和启动子区域中显示了多种变体（图1e）。因此，我们选择了性状CS1B02G090300作为QGL.hau-1B的候选基因，并将其命名为TaGL1-B1。基于TaGL1-B1第9内含子中97 bp的InDel（插入/缺失），我们开发了标记Ta90300，以区分UC1110（指定为TaGL1-B1a）和PI610750（指定为TaGL1-B1b）中的两个等位基因，因为该InDel与UP-RIL后代中的其他变体位点完全连接（图S1）。赋予长粒长的TaGL1-B1b（图1f）被视为进一步分析的优势等位基因。

在UP-RIL中添加Ta90300后重新运行连锁图谱显示，QGL.hau-1B位于Ta90300和Wpt-5279/Wpt-1251之间（图1g），PVE为13.07%–20.54%（表S5）。为了验证TaGL1-B1在自然群体中的作用，我们使用Ta90300鉴定了243份先前使用小麦660基因型的小麦材料 K SNP阵列（Yang等人，2019）。GWAS结果显示，Ta90300在所有染色体上表现出最高的显著性水平（图1h）。t检验表明，含有TaGL1-B1b的小麦材料比含有TaGL1-B1a的小麦材料显示出显著更长的粒长 年（图1i）。

3.2 EMS突变体和过表达揭示了TaGL1调节小麦粒长的重要作用

为了验证TaGL1的作用，我们在 EMS 诱变的四倍体小麦 Kronos 突变体文库中 筛选了四个突变体（K2032 和 K3215 具有TaGL1-A1的过早终止密码子；K2309 和 K329 具有TaGL1-B1的剪接区变体）（图2a；表 S6）。表型分析表明，与野生型 Kronos 相比，田间 TaGL1-A1和TaGL1-B1突变株系的籽粒长度分别减少了 10.60% 和 11.74%（图2b、d）。但除 K3215 外，突变体和野生型之间的粒宽 (GWD) 没有观察到显着差异（图 2c ）). 此外， TaGL1-A1和TaGL1-B1突变系的千粒重 (TGW)分别降低了 36.53% 和 16.33%（图 2e）。上述数据表明，A 和 B 基因组中的TaGL1突变体都减少了籽粒长度。

此外，我们构建了一个包含来自 PI610750 的TaGL1-B1b cDNA 的过表达载体，并将其转移到六倍体小麦 Fielder ( TaGL-B1a ) 中。通过qRT-PCR（图2h）分别在T 0 代和T 1代中检测到 三个TaGL1-过表达阳性系的表达水平，并进一步自交到T 2代。在田间正常收获后对谷粒大小的调查显示，三个独立的TaGL1过表达 ( TaGL1- OE) 转基因品系显着增加了谷粒长度 10.14% 和 TGW 12.40%（图 2f-j) 但与野生型相比，GWD 没有显着差异（图 2g）。这表明TaGL1正向调节小麦籽粒长度，从而改变 TGW。

3.3 TaGL1-B1 与 TaPAP6 强烈相互作用

为了进一步剖析粒长的调控机制，我们使用TaGL1-B1的 cDNA作为诱饵，使用酵母双杂交 (Y2-H) 筛选小麦 cDNA 文库中的相互作用蛋白。选择客户端TaPAP6 (fibrillin_dom)（登录号LS480641 ），因为它可能参与茉莉酸 (JA) 调节（Youssef等人，   2010）。通过分裂荧光素酶互补试验，Y-2H 和烟草叶在酵母细胞中进一步证实了这种相互作用（图 3a、b）。原生质体定位表明 TaGL1-B1 和 TaPAP6 蛋白均定位于叶绿体中（图 3c）。旗叶和种子的 qRT-PCR 分析TaGL1-B1- OE 系（图 3d；图 S5）显示，与 WT 相比， TaPAP6的表达水平增加了大约三倍。这些结果表明TaGL1-B1可能影响TaPAP6的表达。

3.4 TaPAP6的过表达显着增加小麦籽粒长度

为了验证TaPAP6调节粒长的功能，我们构建了一个包含TaPAP6 的过表达载体并将其转移到 Fielder 中。分别在T 0和T 1代中通过qRT-PCR检测TaPAP6过表达的阳性细胞系的表达水平。将三个独立的TaPAP6过表达高表达水平细胞系（图 3g）进一步自交到 T 2代。在田间正常收获后对谷物大小的调查表明TaPAP6 -过表达（TaPAP6-OE) 品系显着增加籽粒长度，平均增加 13.33%，TGW 平均增加 13.94%，但与野生型相比，GWD 没有显着差异（图 3e、   f、h、i）。这些结果表明TaPAP6正向调节小麦籽粒长度。

3.5 TaPAP6可能有助于小麦籽粒中茉莉酸的积累和 ABA 的抑制

作为原纤维蛋白家族的一员，PAP6可能参与茉莉酸 (JA) 调节。因此，我们对TaPAP6- OE 和 WT 系进行了转录组测序，以说明TaPAP6与 JA的关联（图 4a）。TaPAP6- OE 品系中的 RNA-seq 分析鉴定了三个被急剧抑制的JAR1（茉莉酸-氨基合成酶）基因，它们主要通过 KEGG 中 JA 的降解合成茉莉酸-异亮氨酸（JA-Ile）（https://中的 map04075） www.kegg.jp/） 分析。然而，用于 JA 合成的五个基因显着上调（图 4b；表 S9），包括对 JA 生物合成必不可少的酰基辅酶 A 氧化酶 (ACX)。因此，我们推测通过提高TaPAP6的表达抑制JAR1和上调 JA 生物合成基因可能导致 JA 的积累。qRT-PCR进一步证实了JA相关基因在TaPAP6- OE叶片中的表达变化（图 S4）。

为了验证该假设，我们测量了过表达和突变品系中种子和叶片中的 JA 含量。结果显示，与野生型 Fielder 相比， TaPAP6 -OE 细胞系中的 JA 含量显着增加了 36.23%（图 4d；图 S2 C）。与野生型 Fielder 相比，TaGL1 -OE 系中的 JA 含量显着增加了 27.31%（图 4c；图 S2 A），但与野生型 Kronos 相比，   TaGL1突变体中的 JA 含量显着降低了 13.12%–24.42%（图4e；图 S2 B)。

小麦的 JA 和 ABA 生物合成之间存在负相关。为了保持一致，通过 RNA-seq 测定， 包括脱落醛氧化酶（AAO3.1和AAO3.2 ）在内的两个 ABA 合成关键基因在TaPAP6 -OE 系中显着下调（图4b；表 S12）。qRT-PCR进一步证实了ABA相关基因在TaPAP6- OE叶片中的表达变化（图 S4）。测定结果表明，ABA 含量在TaGL1 -OE中显着降低 13.11% ，在TaPAP6 -OE中显着降低 9.67% （图 4f，g）; 图 S2 D、F)，分别与野生型外野手进行比较。相反，与野生型 Kronos 相比，   TaGL1的 EMS 突变系中 ABA 含量增加了 16.22%–22.14%（图4h；图 S2 E）。这些结果揭示了 JA 和 ABA 之间的负相关。总的来说，TaGL1可能通过调节TaPAP6来同时控制 JA 和 ABA，从而增加晶粒长度。

3.6 TaGL1-B1与小麦籽粒类胡萝卜素含量的关系

3.6.1 TaGL1-B1与小麦籽粒中的类胡萝卜素含量显着相关

由于TaGL1-B1被注释为类胡萝卜素异构酶 ( CRTISO )，参与控制不同植物中的类胡萝卜素含量 (CC)（Isaacson等人，   2002 年；Jiang等人，   2021 年），我们测量了 CC 并进行了连锁作图UP-RIL。结果表明，在 1B、2A、4B、5B、5D、6A 和 7A 上检测到七个 QTL，而Ta90300和wPt-5279 / wPt-1251之间的Qcc.hau-1B是所有环境中最稳定的 QTL（图 5a） PVE 为 15.10%–22.55%（表 S8）。TaGL1 -B1b赋予比TaGL1-B1a显着更高的 CC （图 5b）。

为了分析自然种群中TaGL1-B1与 CC的关联，我们使用覆盖Ta90300 的小麦 660 K 阵列对 243 个小麦种质进行了 GWAS 。结果在三种环境中检测到 186 个显着 SNP，但Ta90300在所有染色体中最显着（图 5c）。此外，在两年内的所有六次重复中， 具有TaGL1-B1b 的小麦品种表现出明显高于具有TaGL1-B1a 的小麦品种（图5d）。

3.6.2 突变和过表达揭示了TaGL1-B1 调节小麦类胡萝卜素和叶绿素含量的关键作用

在之前的研究中， TaGL1-B1 ( CRTISO ) 调节 CC的作用在番茄、水稻和拟南芥中得到验证（Fang等人，   2008 年；Isaacson等人，   2002 年；Park等人，   2002 年）。测量结果表明，与野生型 Kronos 相比，   TaGL1-A1突变体的 CC 降低了 8.32% ， TaGL1-B1突变体的 CC 降低了 12.91% （图5e）。过表达系中 CC 的测量表明TaGL1-OE 系中的 CC 增加了 18.88%（图 5f），而在TaPAP6 -OE 系与野生型 Fielder 相比（图 5g）。

类胡萝卜素在光合作用中起着重要作用，因为类胡萝卜素（例如β-胡萝卜素和叶黄素）是光合膜的关键成分。测量结果表明，与野生型Kronos相比，   TaGL1-A1和TaGL1-B1突变体的叶绿素含量分别降低了8.32%和12.91%（图5h）。然而，叶绿素含量在TaGL1-OE系中增加了 18.51% （图 5i），在TaPAP6-OE中增加了 10.56%线与野生型外野手相比（图 5j）。这些结果表明TaGL1在调节小麦植株的光合作用中起着关键作用，可能是通过调节类胡萝卜素含量。

3.7 TaGL1-B1对小麦产量的影响

为了评估TaGL1-B1对产量的影响，我们分别在田间调查了TaGL1过表达和突变系的谷物产量。与野生型 Fielder（图6a ）相比， TaGL1-B1 -OE在 2 年内显着提高了单株产量 26.58%（图 6a）。T 2:3代的三个TaGL1 -OE 品系的每地块（1 m 2）产量在元阳（YY）和郑州（ZZ）分别显着增加 11.46% 和 10.63%（图 6b），而每块TaGL1-A1和TaGL1-B1的产量与野生型 Kronos 相比，突变体在元阳显着降低了 71.36% 和 45.57%，在郑州分别降低了 57.47% 和 28.38%（图 6c   ）。为了确定TaGL1-B1等位基因与自然种群产量的关联，我们还调查了 243 个小麦种质的每块地块 (12.8 m 2 ) 的产量，重复三次。结果表明，在 11 个位置， 具有TaGL1-B1b的品种每地块产量显着高于具有TaGL-B1a 的品种（图6d），增幅范围为 0.80%–2.81% 。

基于我们的发现和之前的研究，我们提出TaGL1-TaPAP6介导小麦籽粒大小和产量。TaGL1积极促进TaPAP6的表达，从而导致 JA 的积累和 ABA 合成的抑制。JA 参与增强的类胡萝卜素（Cotado等人，   2018 年；Sirhindi等人，   2020 年）。总之，类胡萝卜素的增加和 ABA 的减少可以促进光合作用，这为谷物大小和产量提供了池能源。结果，TaGL1-B1的过表达显示出小麦产量的明显增加。

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结论

基于这项工作和之前的报道，我们提出TaGL1-TaPAP6控制小麦的籽粒长度。然而，需要更多的实验工作来说明支持 JA 介导的形态发生以产生形成的调节机制。最后，我们的研究表明TaGL1-B1和TaPAP6共同作用以有利地控制籽粒长度和类胡萝卜素。因此，TaGL1-B1和TaPAP6有利于提高产量的金字塔育种，也为进一步了解 JA 影响小麦籽粒发育提供了新的见解。随着籽粒大小的提高，经常观察到单穗粒数下降或其他不利表型，从而导致小麦产量没有显着变化甚至下降。然而， TaGL1- OE的表达贡献了高产，表明TaGL1基因显示出提高小麦产量的巨大潜力。

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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14009

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