微生物多样性测序

微生物多样性测序是对环境样品中细菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）基因的DNA进行特定长度的PCR扩增并对扩增产物进行测序的分析，可实现对环境样品中的优势物种、稀有物种和一些未知物种进行检测，精准解析微生物在种属水平上的组成和丰度情况，是当前研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段。

16s rDNA测序首先需要提取环境样品的DNA，这些DNA可以来自土壤、粪便、空气或水体等任何来源。

提取DNA后需要经过质检和纯化，一般16s rDNA测序扩增对DNA的总量要求并不高，总量大于100ng，浓度大于10ng/ul一般都可以满足要求。如果是来自和寄主共生的环境如昆虫的肠道微生物，提取时可能包括了寄主本身的大量DNA，对DNA的总量要求会提高。微生物菌群多样性测序受DNA提取和扩增影响很大，不同的扩增区段和扩增引物甚至PCR循环数的差异都会对结果有所影响。因而建议同一项目不同样品的都采用相同的条件和测序方法，这样相互之间才存在可比性。

完成PCR之后的产物一般可以直接上测序仪测序，在上机测序前我们需要对所有样本进行定量和均一化，通常要进行荧光定量PCR。完成定量的样品混合后就可以上机测序。

16s rDNA测序目前可以采用多种不同的测序仪进行测序，包括罗氏的454，Illumina的Novoseq, MiSeq，Hiseq，Life的 PGM 或 Pacbio 以及 nanopore 的三代测序仪。不同的仪器各有优缺点，目前最主流的是Illumina公司的MiSeq，因为其在通量、长度和价格三者之间最为平衡。MiSeq 测序仪可以产生 2x300 bp 的测序读长， Hiseq 和 Novoseq 可以生成 2x250bp 或者 2x150bp 的测序读长，且通量较大。

生物信息分析：

1. 原始数据处理

2. OTU分类和统计

3. 样品构成丰度

4. Alpha多样性指数

5. Beta多样性分析

6. 物种进化树

7. 物种相关性分析

8. 聚类分析

9. 菌群代谢功能预测

10. 基于BugBase的表型分类比较