图1 细胞结构

为准确了解某种蛋白功能，除需对其蛋白结构进行分析外，通常还需清楚其亚细胞定位，以此判断其发挥功能的可能场所。蛋白质亚细胞定位对研究蛋白质的功能非常重要。

亚细胞定位可将某种蛋白或者表达产物定位于细胞中的具体位置，如细胞核内、各种细胞器以及质膜上，从而为理解基因的作用机制提供研究方向。目前研究亚细胞定位最常用的是融合报告基因定位法，将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬时转化技术或稳定遗传转化技术，使得该融合蛋白在受体材料细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器，在扫描共聚焦显微镜的激光照射下会发出绿色荧光，从而可以精确地定位蛋白质的位置。

1）挑取单克隆于5 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养。通常，LB中加入100 μg/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50 μg/ml 大观霉素（载体携带）。

2）将1 ml 过夜培养的农杆菌转接到25 ml LB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。

3）检测过夜培养的菌液OD600的值。

4）5000 g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。

5）室温放置2~3 h后注射烟草。

6）将侵染液装入5 ml 注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

7）注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。

8）通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。

1）还有什么手段进行亚细胞定位？

常用一些在线工具对蛋白亚细胞定位进行预测分析辅助于实验，这样就能省时省力节约成本。下面推荐几个常用的工具：

1. WoLF PSORT II 亚细胞定位预测工具https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar

2. iPSORT亚细胞定位预测工具

http://ipsort.hgc.jp/

3. cNLS Mapper 核定位信号预测工具

http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi

4. SignalP 4.0 Server 信号肽和信号肽剪切位点预测工具

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/

2）为什么有的普通定位结果出来后无法准确判断其定位位置？

细胞中的细胞器复杂且多样，除一些常见的、特征比较明显的细胞器外，有些细胞器在激光共聚焦下形状比较相似，例如：线粒体、过氧化物酶体、高尔基体等细胞器，它们的荧光表达形状可能都是点状，因此不易区分。这时可以结合基因的其他功能研究来判断其可能表达的位置。另外，蛋白表达本身也是一个复杂的过程，涉及到多个合成场所及转运过程，自身表达情况可能比较复杂，因此不易判断具体的表达位置。

3）拍摄时为什么有明场通道？

显示细胞状态，有活力的原生质体细胞应该是饱满圆润的，变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡；显示荧光确实是细胞内蛋白表达的，而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。